免疫組化染色基本技術(shù)及注意事項(xiàng)

1．實(shí)驗(yàn)計(jì)劃

① 根據(jù)課題的內(nèi)容選用動(dòng)物，選用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無(wú) 交叉，則不能用其他 動(dòng)物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必須來(lái)源于鼠，否則不能連接成復(fù)合物。

② 若要比較染色深淺在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間的差異，在貼片方面貼于同一張載片上，否則無(wú)可比性。

③ 選用的試劑可靠，貨源充足，隨時(shí)可取。

2．Ab稀釋度 （如系購(gòu)買的藥盒有工作液和原液）

（1）工作液：無(wú)須稀釋

（2）原液：

① 應(yīng)參照其提供的工作液濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)。

如：工作液濃度為1∶1000， 可選1∶500，1∶1000，1∶1500試驗(yàn)；

若: 1∶500有背景，1∶1000陽(yáng)性反應(yīng)稍淺，可選1∶750進(jìn)行試驗(yàn)。

② 原液的保存（—20℃）凍存——應(yīng)選稀度凍存。

③ 若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10μl/瓶→凍存（-20 ℃）于 冰箱備用。

④ 關(guān)于Ab保存應(yīng)參照說(shuō)明書。

（3）Ab濃度的選擇

Ab濃度不可太高或太低，因?yàn)锳g-Ab結(jié)合需在一定濃度范圍內(nèi)進(jìn)行，若一方過(guò)剩則形成復(fù)合物小且少；極 過(guò)剩時(shí)已形成的復(fù)合物亦會(huì)解體而呈現(xiàn)假陰性。——并非Ab濃度越高越好。

3．Ab滴片技術(shù)

—— 所滴的抗體應(yīng)與切片上的組織剛好吻合。

[注意] 滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。

要領(lǐng)：甩凈組織周圍的水。

4．PBS洗滌技術(shù)

（1）洗滌的目的

① 保證離子濃度和PH值。

② 減少非特異反應(yīng)（平時(shí)Ab不可靠很純）

（2）方法：洗三次，每次5分鐘。

5．Ab孵育技術(shù)

（1）必須在濕盒內(nèi)進(jìn)行，以防抗體的蒸發(fā)和干片。

（2）溫度與時(shí)間 4℃：過(guò)夜；

37℃：2 h or 參考說(shuō)明書

6．光鏡控制顯色方法

（1）室內(nèi)操作：注意溫度與時(shí)間的關(guān)系，室溫zui宜5分鐘。

（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。

對(duì)照組和染色結(jié)果的評(píng)價(jià)

從以下幾 個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)：

1．陽(yáng)性染色特點(diǎn)

① Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。（非特異性～細(xì)胞與組織無(wú)區(qū)別）

② 染色強(qiáng)度不同：顏色深淺不一（非特異性染色 彌散性均勻）

2．組織切片制作過(guò)程的影響

① 固定不良—非特異性染色，顯示不均。

② 邊緣干燥—非特異性染色（常見(jiàn)），加抗體時(shí)勿干片。

3．人工假象與特異性結(jié)果顯示不在同一平面上。

陽(yáng)性對(duì)照：

用已知抗原陽(yáng)性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。對(duì)照切片呈陽(yáng)性結(jié)果，標(biāo)為陽(yáng)性對(duì)照。

陰性對(duì)照：

用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對(duì)照。其實(shí)這只是陰性對(duì)照中的一種，陰性對(duì)照 還應(yīng)包括空白、替代、吸收和抑制實(shí)驗(yàn)。

▲ 染色失敗的幾種原因：

（1）所染的全部切片均為陰性結(jié)果，包括陽(yáng)性 對(duì)照在內(nèi)。全部（－）原因可能：

① 染色未*嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行；

② 漏加一種抗體，或抗體失效；

③ 緩沖液內(nèi)含*，抑制了酶的活性；

④ 底物中所加H2O2 量少或失效；

⑤ 復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)

（2）所有切片均呈陽(yáng)性反應(yīng)，原因可能是：

① 切片在染色過(guò)程中抗體過(guò)濃，或干燥了。

② 緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準(zhǔn)確，洗滌不*。

③ 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

④ 抗體溫育的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

⑤ H2O2 濃度過(guò)高，呈色速度過(guò)快。粘附劑太厚。

（3）所有切片背景過(guò)深，原因可能是：

① 未加酶消化處理切片。

② 切片或涂片過(guò)厚。

③ 漂洗不夠。

④ 底物呈色反應(yīng)過(guò)久。

⑤ 蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血。

⑥ 使用全血清抗體稀釋不夠。

（4）陽(yáng)性對(duì)照染色良好，檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)。

zui常見(jiàn)的原因是：標(biāo)本的固定和處理不當(dāng)。

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